T4 RNA Ligase 2

产品规格

产品简介

T4 RNA Ligase 2，即T4 RNA连接酶2，是一种ATP依赖的双链RNA连接酶（double-strand RNA ligase，dsRNA Ligase），也被称为T4 Rnl 2，可以用于双链RNA进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase 2与T4 RNA Ligase 1（R0502）不同的是，对双链RNA中的nick的连接活性要大大高于对单链RNA末端的连接活性。

T4 RNA Ligase 2也可用于双链核酸(RNA双链、RNA/DNA杂合链或DNA双链)分子内或分子间RNA链的3’羟基和DNA链的5’磷酸基的连接。T4 RNA Ligase 2连接时需要5’磷酸和3’羟基的存在，可以是RNA链或DNA链的5’磷酸基和RNA链的3’羟基之间发生连接反应。

应用：主要用于连接双链RNA中缺刻的连接（即双链RNA的粘端连接），也可用于双链结构中，RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接。

来源：大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因的来源为T4嗜菌体。

产品组分

Storage Buffer：10 mM Tris-HCl (pH7.5)，50 mM KCl，35 mM (NH4)2SO4，0.1 mM EDTA，0.1 mM DTT，50% (v/v) Glycerol。

10X Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl(pH 7.5 )，20 mM MgCl₂，10 mM DTT，40 mM ATP

失活或抑制：85℃加热5 min可使T4 RNA Ligase 2失活，也可加入蛋白酶K或EDTA抑制其活性。

质量控制

1、无RNase、DNase污染。

2、经考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色判断，T4 RNA连接酶2纯度>90%。

活性单位定义

一个单位的定义是在37℃下，在20 µL的30分钟内连接0.4 µg 23-mer和17-mer RNAs的等摩尔混合物所需的酶量。

反应体系及条件

1、双链RNA或DNA/RNA杂合双链的底物制备：

将RNA混合物或DNA和RNA的混合物（按摩尔质量比1：1混合），推荐的终浓度为20 µM (10-50 µM均可)，65℃孵育3 min，然后冰上孵育2 min。

2、双链结构中RNA 3’羟基和DNA 5’磷酸基连接的反应体系（于冰盒上配制）：

3、对于双链 RNA 缺刻的连接，使用T4 RNA Ligase 2连接的反应体系（于冰盒上配制）:

反应条件

连接反应：37℃孵育30 min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2 h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。

终止反应*：反应结束后加入蛋白酶K或EDTA，即可终止反应。

*由于T4 RNA Ligase 2热失活需要85℃加热5 min，这样可能导致dsRNA或DNA/RNA杂合双链变性，因此通常不建议通过加热方式失活T4 RNA Ligase 2。如果后续无需保持双链状态，则推荐85℃加热5 min以失活T4 RNA Ligase 2。

注意事项

1、由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA，双链RNA可以耐受RNase A和RNase T1等。如果涉及单链RNA，包括dsRNA制备后存在部分RNA序列是单链的情况，可以考虑适量添加RNase Inhibitor；

2、如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase inhibitor、DEPC水等；

3、反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1 µM，在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中， 例如由于底物量有限等原因，可以适当减少Nicked dsRNASubstrate的用量，例如使最终浓度为0.5 µM或0.2 µM等；

4、本产品仅限于专业人员的科学研究用，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。