T4 RNA Ligase 2
T4 RNA Ligase 2,即T4 RNA连接酶2,是一种ATP依赖的双链RNA连接酶(double-strand RNA ligase,dsRNA Ligase),也被称为T4 Rnl 2,可以用于双链RNA进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase 2与T4 RNA Ligase 1(R0502)不同的是,对双链RNA中的nick的连接活性要大大高于对单链RNA末端的连接活性。
T4 RNA Ligase 2也可用于双链核酸(RNA双链、RNA/DNA杂合链或DNA双链)分子内或分子间RNA链的3’羟基和DNA链的5’磷酸基的连接。T4 RNA Ligase 2连接时需要5’磷酸和3’羟基的存在,可以是RNA链或DNA链的5’磷酸基和RNA链的3’羟基之间发生连接反应。
应用:主要用于连接双链RNA中缺刻的连接(即双链RNA的粘端连接),也可用于双链结构中,RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接。
来源:大肠杆菌表达的重组蛋白,表达基因的来源为T4嗜菌体。
产品组分
Storage Buffer:10 mM Tris-HCl (pH7.5),50 mM KCl,35 mM (NH4)2SO4,0.1 mM EDTA,0.1 mM DTT,50% (v/v) Glycerol。
10X Reaction Buffer:500 mM Tris-HCl(pH 7.5 ),20 mM MgCl2,10 mM DTT,40 mM ATP
失活或抑制:85℃加热5 min可使T4 RNA Ligase 2失活,也可加入蛋白酶K或EDTA抑制其活性。
质量控制
1、无RNase、DNase污染。
2、经考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色判断,T4 RNA连接酶2纯度>90%。
活性单位定义
一个单位的定义是在37℃下,在20 µL的30分钟内连接0.4 µg 23-mer和17-mer RNAs的等摩尔混合物所需的酶量。
反应体系及条件
1、双链RNA或DNA/RNA杂合双链的底物制备:
将RNA混合物或DNA和RNA的混合物(按摩尔质量比1:1混合),推荐的终浓度为20 µM (10-50 µM均可),65℃孵育3 min,然后冰上孵育2 min。
2、双链结构中RNA 3’羟基和DNA 5’磷酸基连接的反应体系(于冰盒上配制):
3、对于双链 RNA 缺刻的连接,使用T4 RNA Ligase 2连接的反应体系(于冰盒上配制):
反应条件
*由于T4 RNA Ligase 2热失活需要85℃加热5 min,这样可能导致dsRNA或DNA/RNA杂合双链变性,因此通常不建议通过加热方式失活T4 RNA Ligase 2。如果后续无需保持双链状态,则推荐85℃加热5 min以失活T4 RNA Ligase 2。
注意事项
1、由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA,双链RNA可以耐受RNase A和RNase T1等。如果涉及单链RNA,包括dsRNA制备后存在部分RNA序列是单链的情况,可以考虑适量添加RNase Inhibitor;
2、如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。可根据具体应用选择合适的操作方法,可能需准备额外的试剂,如RNase inhibitor、DEPC水等;
3、反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1 µM,在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中, 例如由于底物量有限等原因,可以适当减少Nicked dsRNASubstrate的用量,例如使最终浓度为0.5 µM或0.2 µM等;
4、本产品仅限于专业人员的科学研究用,为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。