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T4 RNA 连接酶1


T4 RNA Ligase 1

产品规格

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产品简介

T4 RNA Ligase 1,即T4 RNA连接酶1,是一种依赖ATP的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。可用于ssRNA的分子间连接;ssRNAssDNA的分子间连接;ssRNA 3′-OH末端用放射性同位素5’-[ 32P]pCp等的标记;单链Oligo RNAOligo DNA的合成;tRNA的特别修饰;在蛋白质中引入非天然氨基酸等。

来源:大肠杆菌表达的重组蛋白,表达基因的来源为T4嗜菌体。


产品组分

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Storage Buffer10 mM Tris-HCl(pH 7.4),50 mM KCl,1 mM DTT,0.1 mM EDTA,50% Glycerol

10X Reaction Buffer500 mM Tris-HCl (pH 7.5),100 mM MgCl2,10 mM DTT

失活或抑制:65加热15 min或煮沸2 min可使其失活或加入10%体积的0.5 M EDTA( pH8.0)也可以终止反应。


质量控制

1、无RNaseDNase污染。

2、经考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色判断,其纯度>90%


活性单位定义

37℃下,在5’末端浓度为10 µM时,在30 min内催化1 nM5’-[32P]rA16形成抗磷酸酶形式所需的酶的量被定义为一个单位。


反应体系

1、对于单链RNA的环化连接反应,请于冰盒上按下表配制反应体系:

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2、对于单链RNADNA的分子间连接反应,请于冰盒上按下表配制反应体系:

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注意:

(1)由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要是RNase free的。由于涉及单链RNA,可以考虑适量添加RNase Inhibitor,推荐反应终浓度为1-2 U/µL,即使不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。

(2)上述表格中ssRNA的用量已经比较大,对于样品比较少的情况下,可以大幅减少ssRNA的用量的。

(3)根据连接反应的类型,推荐在反应体系中加入适量的PEG8000。建议连接单链RNADNA的分之间连接反应体系中PEG8000的终浓度为15%-25%,这样既不影响反应特性也可以显著提高酶活性。

 

反应条件

37℃孵育30 min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2 h16℃孵育16 h。为了使连接反应更加充分,可以适当延长连接反应时间。

 

注意事项

1、本产品连接的底物无论是单链RNA还是单链DNA,都需要确保5’末端磷酸化或腺苷酰化,同时3’末端是羟基;

2、如果连接底物为双链RNADNA,推荐使用T4 RNA Ligase 2等;

3、可根据具体应用选择合适的操作方法,可能需准备额外的试剂,如RNase inhibitorDEPC水等;

4、本试剂盒提供的ATP浓度为10 mM,请根据实际操作进行稀释使用;

5、本产品仅限于专业人员的科学研究用,为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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