ssRNA Cyclase

产品规格

产品简介

ssRNA Cyclase是一种耐热连接酶，可催化单链DNA（ssDNA）和单链RNA（ssRNA）底物的离子分子连接（即环化），这些底物同时具有5’-单磷酸和3’-羟基。大于15个碱基的线性ssDNAs和ssRNAs被ssRNA Cyclase环状化。环化反应中，要求催化底物单链DNA/RNA具有5’-磷酸基团和3’-OH基团。对于大于15 nt的单链底物，该酶都能高效的连接。

ssRNA Cyclase能生产用于滚动圈复制或滚动圈转录实验和下一代测序的单链DNA模板以及生产大于15 nt环状RNA。

图1 使用吉赛生物ssRNA Cyclase试剂盒制备环状RNA的效果图

反应体系为20 µL，长度为307 nt的单链RNA的终浓度为1 μM，反应条件为45℃孵育60 min，随后取样用6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终经SYBR™ Gold核酸染料孵育后荧光成像分析。如图所示，本试剂盒在60 min内就可以将85%以上的5’磷酸化3’羟基的单链RNA转化为环状RNA。

产品组分

Storage Buffer：10 mM Tris-HC1 (pH 7.5)，50 mM KCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，50% Glycerol。

10X Cyclase reaction buffer：500 mM Tris-HC1(pH 7.5)，100 mM KCl，50 mM MgCl₂，10 mM DTT。对于ssDNA的环化，我们建议添加MnCl₂最终浓度2.5 mM。

质量控制

1、无RNase、DNase污染。

2、经考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色判断，纯度>90%。

反应体系

按以下组分配制反应液：

反应条件

环化反应：45℃孵育60min。

注意事项

1、使用本试剂盒时，请穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩、使用RNase-free耗材，避免RNase污染。

2、由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA，可以考虑适量添加RNase Inhibitor，推荐反应终浓度为1-2U/µL，尽管不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。

3、连接底物必须是磷酸化。

4、对于ssDNA的环化，如寡脱氧核苷酸或cDNA，将MnCl₂添加到最终浓度为2.5mM。

5、使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳时，请使用已预冷的电泳缓冲液或在冰水浴中电泳，以防电泳过程温度过高导致RNA降解。