ssRNA Cyclase
ssRNA Cyclase是一种耐热连接酶,可催化单链DNA(ssDNA)和单链RNA(ssRNA)底物的离子分子连接(即环化),这些底物同时具有5’-单磷酸和3’-羟基。大于15个碱基的线性ssDNAs和ssRNAs被ssRNA Cyclase环状化。环化反应中,要求催化底物单链DNA/RNA具有5’-磷酸基团和3’-OH基团。对于大于15 nt的单链底物,该酶都能高效的连接。
ssRNA Cyclase能生产用于滚动圈复制或滚动圈转录实验和下一代测序的单链DNA模板以及生产大于15 nt环状RNA。
图1 使用吉赛生物ssRNA Cyclase试剂盒制备环状RNA的效果图
反应体系为20 µL,长度为307 nt的单链RNA的终浓度为1 μM,反应条件为45℃孵育60 min,随后取样用6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,最终经SYBR™ Gold核酸染料孵育后荧光成像分析。如图所示,本试剂盒在60 min内就可以将85%以上的5’磷酸化3’羟基的单链RNA转化为环状RNA。
产品组分
Storage Buffer:10 mM Tris-HC1 (pH 7.5),50 mM KCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,50% Glycerol。
10X Cyclase reaction buffer:500 mM Tris-HC1(pH 7.5),100 mM KCl,50 mM MgCl2,10 mM DTT。对于ssDNA的环化,我们建议添加MnCl2最终浓度2.5 mM。
质量控制
1、无RNase、DNase污染。
2、经考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色判断,纯度>90%。
反应体系
按以下组分配制反应液:
反应条件
环化反应:45℃孵育60min。
注意事项
1、使用本试剂盒时,请穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩、使用RNase-free耗材,避免RNase污染。
2、由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA,可以考虑适量添加RNase Inhibitor,推荐反应终浓度为1-2U/µL,尽管不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
3、连接底物必须是磷酸化。
4、对于ssDNA的环化,如寡脱氧核苷酸或cDNA,将MnCl2添加到最终浓度为2.5mM。
5、使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳时,请使用已预冷的电泳缓冲液或在冰水浴中电泳,以防电泳过程温度过高导致RNA降解。