CircLuc
CircLuc是编码萤火虫荧光素酶基因(Luciferase)的环状RNA,转染真核细胞后可表达荧光素酶蛋白,可作为环状RNA转染的阳性对照。
产品干冰运输。-80℃ 超低温保存,可以稳定存放一年。
1.请严格遵循RNA的操作规则,实验过程中请戴好手套和口罩,避免外界因素导致产品降解。
2.首次使用时,请将产品瞬时离心,尽可能避免多次反复冻融,不要涡旋震荡。
3.实验过程中,请将本产品置于冰上,使用完毕后请于-80℃保存。
本实验方法以使用Lipofectamine®3000转染试剂于12孔板转染1 μg/μL CircLuc为例,其他规格转染体系请参考下表,使用其他转染试剂请参考具体转染试剂说明书。
(1)接种细胞
转染前一天将细胞铺至12孔板,使转染时的细胞密度达到约60%-70%。
注:不同细胞生长速度不同,接种细胞的数量、细胞密度需要依据细胞类型、培养时间、实验目的而定,一般情况以控制到检测时细胞接近长满为宜;每孔接种的细胞数量应尽量相同,使细胞均匀分布。
(2)转染
对于每个转染样品,请按下面的步骤进行准备:
1)溶解circRNA:先将冻干粉产品瞬时离心,加入10 μL Nuclease-free Water至10 μg的CircLuc冻干粉中,制成1 μg/μL CircLuc的溶液;
2)稀释转染试剂:50 μL Opti-MEMTM Medium(V1)中加入3 μL Lipofectamine®3000 Transfection Reagent(V2),轻轻混匀,室温孵育10 min;
3)稀释circRNA:另一管50 μL Opti-MEMTM Medium(V1)中加入3 μL的P3000TM试剂和1 μL 的1 μg/μL CircLuc(V3),轻轻混匀;
4)将稀释好的转染试剂与稀释好的CircLuc混合,室温孵育5 min。
5)12孔板每孔更换新鲜完全培养基900 μL(V4);
6)将100 μL CircLuc转染混合液,加入到含900 μL完全培养基的细胞中,轻轻混匀;
7)将细胞置于37℃的CO2培养箱中培养24 - 48小时;
8)使用萤火虫荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性(详细检测方法参考对应的荧光素酶检测试剂盒说明书)。
CircLuc能够在真核细胞中高效进行荧光素酶的翻译。下图为使用制备的CircLuc转染293T细胞的案例。
图1:CircLuc转染293T细胞48h后荧光素酶检测结果