RNA-seq Library Prep Kit for Illumina

产品简介

RNA-seq Library Prep Kit for Illumina是一款应用于全转录组链特异性文库构建的专用试剂盒。试剂盒采用优化的流程以及反应体系，提高了文库的转化效率，对不同起始量的RNA都有均一的覆盖度，4h可完成文库制备。试剂盒可以衔接Poly(A)法富集mRNA试剂盒和rRNA去除试剂盒构建测序文库。使用高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证了文库构建的稳定性和重复性。

适用范围

RNA-seq Library Prep Kit for Illumina适用于完整性良好的动、植物及真菌等真核生物总RNA、经Poly(A)法富集的mRNA、经rRNA去除后的RNA链特异性文库构建。不同样品的Total RNA中mRNA、lncRNA和circRNA的含量差异较大。投入量与前端模块有关：

Ribomoval™ rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)（#S0103）：0.1–1μg Total RNA

Ribomoval™ rRNA Depletion Kit (Plant)（#S0203）：0.1–2μg Total RNA

产品组分

运输与保存

干冰运输，-30℃~ -15℃ 保存，有效期一年。

自备材料

DNA纯化磁珠、Nuclease-free ddH2O、无水乙醇、低吸附吸头、Nuclease-free PCR管、磁力架、PCR仪、Qubit、Agilent 2100 Bioanalyzer等。

实验流程

1、Total RNA片段化

1）按照表1在一个Nuclease-free PCR管中以实际反应数1.1倍配制RNA片段化反应混合液：

2）将样品从磁力架上取出，加入22μL Frag/Prime Buffer(1×)，用移液器吹打10次以充 分混匀，室温静置3min，在磁力架上静置5min，待溶液澄清后，小心吸取20μL上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。

3）将样品置于PCR仪中，按照表2程序，进行RNA片段化反应，热盖温度105℃。

2、1st Strand Synthesis

1）按照表3配制1st Strand Synthesis反应混合液：

2）用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

3）将样品置于PCR仪中，按照表4程序，进行1st Strand Synthesis反应，热盖温度105℃。

3、2nd Strand Synthesis and dA-tailing

1）按照表5配制2nd Strand Synthesis and dA-tailing反应混合液：

2）用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

3）将样品置于PCR仪中，按照表6程序，进行2nd Strand Synthesis and dA-tailing反应，热盖温度105℃。

4、Adapter Ligation

1）按照表7配制Adapter Ligation反应混合液：

2）用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

3）将样品置于PCR仪中，按照表8程序，进行Adapter Ligation反应，热盖温度105℃。

5、连接产物纯化

1）将磁珠从-4℃冰箱中取出，室温平衡至少30 min；

2）用Nuclease-free ddH2O配制80%乙醇；

3）旋涡震荡充分混匀磁珠；

4）吸取73μL（0.73×）磁珠至接头连接产物中，吹打混匀，室温静置5 min，转移PCR管至磁力架上，直至溶液变澄清，小心移除上清；

5）保持PCR管在磁力架上，加入200μL 80%乙醇，静置30sec，小心移除上清；

6）重复5）一次，用10μL移液器彻底吸干残留液体；

7）保持PCR管在磁力架上，干燥磁珠5-10min；

8）将PCR管从磁力架上取出，加入22μL Nuclease-free ddH2O，用移液器吹打混匀，室温静置5min；

9）将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取20 μL上清至新的Nuclease-free PCR管中，然后加入16μL（0.8×）磁珠，吹打混匀，室温静置5min，转移PCR管至磁力架上，直至溶液变澄清，小心移除上清；

10）保持PCR管在磁力架上，加入200μL 80%乙醇，静置30sec，小心移除上清；

11）重复5）一次，用10μL移液器彻底吸干残留液体；

12）保持PCR管在磁力架上，干燥磁珠5-10min；

13）将PCR管从磁力架上取出，加入12μL Nuclease-free ddH2O，用移液器吹打混匀，室温静置5min；

14）将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取10μL上清至新的Nuclease-free PCR管中备用。

6、Library Amplification

1）按照表9配制Library Amplification反应混合液：

2）用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

3）将样品置于PCR仪中，按照表10程序，进行Library Amplification反应，热盖温度105℃。

4）推荐循环数

7、PCR产物纯化

1）将磁珠从-4℃冰箱中取出，室温平衡至少30min；

2）用Nuclease-free ddH2O配制80%乙醇；

3）旋涡震荡充分混匀磁珠；

4）吸取22.5μL（0.9×）磁珠至PCR产物中，吹打混匀，室温静置5min，转移PCR管至磁力架上，直至溶液变澄清，小心移除上清；

5）保持PCR管在磁力架上，加入200μL 80%乙醇，静置30s，小心移除上清；

6）重复5）一次，用10μL移液器彻底吸干残留液体；

7）保持PCR管在磁力架上，干燥磁珠5-10min；

8）将PCR管从磁力架上取出，加入20μL Nuclease-free ddH2O，用移液器吹打混匀，室温静置5 min；

9）将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取18μL上清至新的Nuclease-free离心管中。

8、文库质检

1）用Qubit检测文库浓度，2100检测文库的片段分布。