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核糖体RNA去除试剂盒(人/大鼠/小鼠)

Ribomoval™ rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)


产品简介

Ribomoval™ rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)采用RNase H消化法去除人、小鼠和大鼠Total RNA中的核糖体RNA(包括28S18S5.8S5S和线粒体rRNA 16S12S),保留mRNA和其他非编码RNA信息(lncRNAcircRNA等)。本试剂盒对于完整和部分降解的RNA均有良好的rRNA去除效果,经rRNA去除所获得的RNA可用于mRNA和非编码RNA的高通量测序分析,能显著提高测序结果中有效数据比例。


适用范围

适用于人、小鼠或大鼠来源的0.1~1μg Total RNA样本。


产品组分

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运输与保存

干冰运输,-30℃~ -15℃保存,有效期一年。

自备材料

RNA纯化磁珠、Nuclease-free ddH2O、无水乙醇、低吸附吸头、Nuclease-free PCR管、磁力架、PCR仪等。


注意事项

1.为保证rRNA去除效率,RNA样品不应含盐离子(例如Mg2+或胍盐)和有机物(例如苯酚和乙醇)。

2.RNA样品不应有基因组DNA污染,若样品中有gDNA残留,应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3.RNA样品最大投入体积为11μL,若样品体积较大,可先进行RNA样品浓缩。

4.用于RNA-Seq的样品,建议Total RNA起始量高于100 ng,以增加文库的复杂性。


实验流程

1.探针杂交

1.1在一个200μL Nuclease-free PCR管中,用Nuclease-free ddH2O0.1~1μg Total RNA稀释至11μL,置于冰上备用。

1.2按照表1在一个Nuclease-free PCR管中配制探针杂交反应体系。有多个样品时,可先将Probe BufferProbe Mix (H/M/R)混合配成Master Mix,按照实际反应数的1.1倍配置体积,以抵消吸液损耗。然后准确吸取5 μL Master Mix加入Total RNA中。

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1.3使用移液器轻轻吹打混匀,瞬时离心将样品收集至管底。

1.4将样品置于PCR仪中,按以下程序操作,进行探针杂交反应,设置热盖温度105℃

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2.rRNA去除

2.1按照表3配置RNase H消化反应体系。有多个样品时,可先将RNase H BufferRNase H混合配成Master Mix,按照实际反应数的1.1倍配置体积,以抵消吸液损耗。然后准确吸取5μLMaster Mix加入上一步产物中。

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2.2使用移液器轻轻吹打混匀,瞬时离心将样品收集至管底。

2.3将上述样品置于PCR仪中,设置反应程序:37℃ 30 min4℃ Hold,热盖温度105℃

 

3.DNase I消化

3.1按照表4配制DNase I消化反应体系。有多个样品时,可先将DNase I BufferDNase I混合配成Master Mix,按照实际反应数的1.1倍配置体积,以抵消吸液损耗。然后准确吸取30 μL Master Mix加入上一步产物中。

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3.2使用移液器轻轻吹打混匀,瞬时离心将样品收集至管底。

3.3将上述样品置于PCR仪中,设置反应程序:37℃ 30 min4℃ Hold,热盖温度105℃

4.RNA纯化

1.1准备工作:将RNA磁珠从冰箱中取出,室温平衡至少30min。另外用Nuclease-free ddH2O配制80%乙醇待用。

1.2涡旋震荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

1.3吸取110μL RNA磁珠(2.2×,Beads:RNA=2.2:1)至上一步产物中,使用移液器充分吹打混匀,室温孵育5 min

1.4将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5min),小心吸弃上清。

1.5保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL Nuclease-free ddH2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心吸弃上清。

1.6重复步骤4.5,总计漂洗两次,用10μL吸头吸弃残留液体。

1.7保持PCR管始终置于磁力架中,室温下开盖干燥磁珠5~10min

1.8RNA洗脱:将PCR管从磁力架上取下,加入11μL Nuclease-free ddH2O(或使用适合下游实验的相应体积Nuclease-free ddH2O或洗脱缓冲液),使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

1.9将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3min),小心移取10 μL上清(可根据步骤4.8选择的实际洗脱体积进行相应调整)至新的Nuclease-free PCR管中。

【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验,或置于-80℃存放。


案例展示

研究一:高通量测序验证Ribomoval™ rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) 对rRNA去除效果

实验各取三份1μg 0.1μg Human/Mouse/Rat total RNA 利用Ribomoval™ rRNA Depletion Kit K company 试剂盒对rRNA进行去除,对未进行rRNA去除与rRNA去除后的样品搭配吉赛生物自主研发的RNA文库制备试剂盒(#S05)进行文库构建,测序后并与其基因组数据库进行对比。

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图1 显示Ribomoval™ rRNA Depletion Kit1μg 0.1μg Human/Mouse/Rat totalRNA中的rRNA均有显著去除效果。同时与K company试剂盒对比,Ribomoval™ rRNA Depletion KitrRNA残留率更低,去除效果更优。

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