Ribomoval™ rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

产品简介

Ribomoval™ rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)采用RNase H消化法去除人、小鼠和大鼠Total RNA中的核糖体RNA（包括28S、18S、5.8S、5S和线粒体rRNA 16S、12S），保留mRNA和其他非编码RNA信息（lncRNA、circRNA等）。本试剂盒对于完整和部分降解的RNA均有良好的rRNA去除效果，经rRNA去除所获得的RNA可用于mRNA和非编码RNA的高通量测序分析，能显著提高测序结果中有效数据比例。

适用范围

适用于人、小鼠或大鼠来源的0.1~1μg Total RNA样本。

产品组分

运输与保存

干冰运输，-30℃~ -15℃保存，有效期一年。

自备材料

RNA纯化磁珠、Nuclease-free ddH2O、无水乙醇、低吸附吸头、Nuclease-free PCR管、磁力架、PCR仪等。

注意事项

1.为保证rRNA去除效率，RNA样品不应含盐离子（例如Mg2+或胍盐）和有机物（例如苯酚和乙醇）。

2.RNA样品不应有基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3.RNA样品最大投入体积为11μL，若样品体积较大，可先进行RNA样品浓缩。

4.用于RNA-Seq的样品，建议Total RNA起始量高于100 ng，以增加文库的复杂性。

实验流程

1.探针杂交

1.1在一个200μL Nuclease-free PCR管中，用Nuclease-free ddH2O将0.1~1μg Total RNA稀释至11μL，置于冰上备用。

1.2按照表1在一个Nuclease-free PCR管中配制探针杂交反应体系。有多个样品时，可先将Probe Buffer和Probe Mix (H/M/R)混合配成Master Mix，按照实际反应数的1.1倍配置体积，以抵消吸液损耗。然后准确吸取5 μL Master Mix加入Total RNA中。

1.3使用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

1.4将样品置于PCR仪中，按以下程序操作，进行探针杂交反应，设置热盖温度105℃。

2.rRNA去除

2.1按照表3配置RNase H消化反应体系。有多个样品时，可先将RNase H Buffer和RNase H混合配成Master Mix，按照实际反应数的1.1倍配置体积，以抵消吸液损耗。然后准确吸取5μLMaster Mix加入上一步产物中。

2.2使用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

2.3将上述样品置于PCR仪中，设置反应程序：37℃ 30 min，4℃ Hold，热盖温度105℃。

3.DNase I消化

3.1按照表4配制DNase I消化反应体系。有多个样品时，可先将DNase I Buffer和DNase I混合配成Master Mix，按照实际反应数的1.1倍配置体积，以抵消吸液损耗。然后准确吸取30 μL Master Mix加入上一步产物中。

3.2使用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心将样品收集至管底。

3.3将上述样品置于PCR仪中，设置反应程序：37℃ 30 min，4℃ Hold，热盖温度105℃。

4.RNA纯化

1.1准备工作：将RNA磁珠从冰箱中取出，室温平衡至少30min。另外用Nuclease-free ddH2O配制80%乙醇待用。

1.2涡旋震荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

1.3吸取110μL RNA磁珠（2.2×，Beads:RNA=2.2:1）至上一步产物中，使用移液器充分吹打混匀，室温孵育5 min。

1.4将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心吸弃上清。

1.5保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL Nuclease-free ddH2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心吸弃上清。

1.6重复步骤4.5，总计漂洗两次，用10μL吸头吸弃残留液体。

1.7保持PCR管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠5~10min。

1.8RNA洗脱：将PCR管从磁力架上取下，加入11μL Nuclease-free ddH2O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease-free ddH2O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

1.9将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3min），小心移取10 μL上清（可根据步骤4.8选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease-free PCR管中。

【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80℃存放。

案例展示

研究一：高通量测序验证Ribomoval™ rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) 对rRNA去除效果

实验各取三份1μg 和0.1μg Human/Mouse/Rat total RNA 利用Ribomoval™ rRNA Depletion Kit 及K company 试剂盒对rRNA进行去除，对未进行rRNA去除与rRNA去除后的样品搭配吉赛生物自主研发的RNA文库制备试剂盒（#S05）进行文库构建，测序后并与其基因组数据库进行对比。

图1 显示Ribomoval™ rRNA Depletion Kit对1μg 和0.1μg Human/Mouse/Rat totalRNA中的rRNA均有显著去除效果。同时与K company试剂盒对比，Ribomoval™ rRNA Depletion Kit的rRNA残留率更低，去除效果更优。