RNA Immunoprecipitation Kit

Cat.No. P0101  (12T)

Cat.No. P0102  (24T)

Sufficient reagent for RIP assays per kit

Store at -20℃ to 4℃

背景介绍

RNA Immunoprecipitation（RIP）是研究细胞内RNA与蛋白结合的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。

RIP利用特异性抗体对目标蛋白进行捕获，实现目标蛋白-RNA复合物的富集，再通过对复合物中蛋白和RNA的检测和分析，探索分子间相互结合关系。分离复合物中的RNA，经过逆转录或构建cDNA文库，最后利用基因特异性分析技术（PCR、qRT-PCR）或高通量分析技术（高通量测序、基因芯片），分析复合物中RNA的类型及多少；分离复合物中的蛋白，通过WB或质谱等方法，还可以用来做质控、检测目标蛋白抗体质量以及研究与目标蛋白结合的其他互作蛋白。

应用范围

l 与目标蛋白结合的RNA及其他相互作用蛋白分析；

l  RBP结合RNA motif鉴定；

l  不适用膜结合蛋白、DNA结合蛋白（组蛋白、核仁蛋白等）的RIP实验。

实验原理图

试剂盒组分

注：对照（IgG）组与实验（IP）组消耗试剂量相同，一次免疫沉淀(含Input组、IP组及IgG组)，要消耗2T次试剂量。

自备材料

实验前试剂准备

 注：1）以上试剂每次实验前需新鲜配置

  2）* 标记表示该试剂根据实验需求选择性使用

实验操作流程图

实验时间管理

1.目的蛋白

1)目的蛋白抗体和IgG抗体应种属一致，且为IP级。使用量一般为5ug，或参考抗体说明书中推荐的用量。

2.细胞裂解

每个RIP使用的细胞总数必须根据RNA结合蛋白的丰度进行优化。如目的蛋白内源表达低，就需要增加细胞用量。通常，一次RIP反应1E7的细胞量对应1mL 稀释后的Buffer A，但最高3E7的细胞量也有测试过可以成功裂解。

3.RNase控制

在整个实验中，应采取所有标准预防措施以尽量减少RNase污染。如所有步骤都应戴手套，所有接触细胞或细胞裂解物的仪器、玻璃器皿和塑料器皿应经认证的无核酸酶或应使用DEPC或其他RNase灭活试剂进行预处理。试剂盒含有RNase抑制剂，请按协议中说明进行操作。

4.细胞样品准备

1)贴壁细胞

l刮取细胞

①从培养皿或培养板上刮下细胞，转移到离心管，细胞计数；

②1000 rpm离心5分钟收集细胞，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞两次；

③4℃，1000 rpm离心5分钟收集细胞，弃上清（可放-80℃保存）。

l消化液消化收取细胞

①弃掉培养基，用PBS冲洗细胞一次；

②加胰蛋白酶消化解离细胞；

③加10倍体积的完全细胞培养基终止消化，收集细胞计数，转移到离心管；

④1000 rpm离心5分钟收集细胞，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞两次；

⑤4℃，1000 rpm离心5分钟收集细胞，弃上清（可放-80℃保存）。

2)悬浮细胞

①将细胞收到锥形管中，细胞计数。

②1000 rpm离心5分钟收集细胞，弃上清。

③将细胞重悬在预冷的10ml PBS中清洗。4℃，1000 rpm离心5分钟收集细胞，弃上清。

④重复步骤3（可放置-80℃保存）。

注意事项：

a)保存时间不宜过久，新鲜的样本有利于RIP实验的成功。

实验操作

1.样品提取

●组织样品：

1)取100 mg新鲜组织加入1 mL PBS（自备）进行洗涤，去除血液等；

2)将洗净组织放入匀浆器，加入1 mL Buffer A（1×）工作液（DEPC水10倍稀释【1】，使用前加入1%体积蛋白酶抑制剂【6】和1%体积RNase抑制剂【7】），进行研磨，期间每研磨1 min置于冰上冷却30 s，充分研磨后转置于1.5 mL无RNase离心管；

3)4℃，14000 g离心，10 min取上清。

●细胞样品：

1)1×10⁷个收集的细胞加入1 mL Buffer A（1×）工作液（DEPC水10倍稀释【1】，使用前加入1%体积蛋白酶抑制剂【6】和1%体积RNase抑制剂【7】），吹打混匀，置于冰上裂解10 min，期间涡旋重悬2次，每次5 s；

2)4℃，14000 g离心，10 min取上清。

注意事项：

a)使用无RNase的吸头及离心管，尽量降低环境中RNase对实验的影响；

b)PBS（自备）洗涤应轻柔，勿使细胞破碎；

c)细胞裂解时，应温和，防止核酸析出聚集成团；

d)组织样品离心后取上清，应避免吸取到脂肪等不溶杂质；

2.样品预处理

1)取100μL上清作为Input对照（标记为1号管），剩余900 μL置于无RNase离心管中。

2)*在900μL上清中加入100 μL protein A+G beads【4】，于4℃，10转/min旋转反应10min；

3)*置于磁力架取上清，弃磁珠；

注意事项：

a)如果当天不能进行第5步，Input对照组上清液需加入Buffer E立即放置-80℃保存。如当天可以进行第5步，可先加入Buffer E 后保存在-20℃。也可合理安排实验时间，在第5步捕获抗原前半小时完成样品的处理，可减少反复冻融对样品的伤害。

b)2）*3）*步骤为可选择步骤，使用protein A+G beads【4】对样品进行预处理，对改善磁珠非特异结合有一定的帮助；

3.磁珠预处理

1)取200 μL protein A+G beads【4】，加入Buffer A（1×）【1】1 mL，涡旋5 s，置于磁力架，弃去上清；

2)重复洗涤1次；

3)加入Buffer A（1×）【1】1 mL，Buffer D【5】20 μL，于4℃，10转/min旋转反应30 min；

4)置于磁力架弃上清；

5)加入Buffer A（1×）【1】1 mL，涡旋洗涤5 s，置于磁力架弃上清；

6)加入Buffer A（1×）【1】1 mL，充分混匀后分为2份，各500 μL；

7)置于磁力架弃上清，分别标记为2号管（RIP），3号管（IgG）。

注意事项：

a)如果产物用于测序，Buffer D可以选择不添加，其中的成分或对测序有影响；

4.抗体与磁珠连接

1)经封闭处理的两管beads各加入Buffer A（1×）【1】1 mL，RIP抗体（2号管）或IgG（3号管）5 μg，于4℃，10转/min旋转反应1~2 h；

2)反应完成后，置于磁力架弃上清；

3)使用Buffer A（1×）【1】1 mL涡旋洗涤5 s，置于磁力架弃上清；

4)重复洗涤1次，置于磁力架弃上清。

5.捕获抗原

1)在结合了RIP抗体（2号管）或IgG（3号管）的磁珠中加入350 μL Buffer A（1×）【1】、组织或细胞裂解上清450 μL，4℃、10转/min旋转反应2h~过夜。

2)反应完成后，置于磁力架弃上清。

注意事项：

a)长时间的反应会增加背景；

b)适当的增加反应时间或许对目标的捕获有利；

c)如果抗原的丰度较低，可适当减少Buffer A（1×）【1】的加入量，更好的选择是在提取的时候使用更大的组织或细胞量。

6.洗涤

1)在磁珠复合物中加入1 mL Buffer B（1×）【2】或Buffer C（1×）（strong）【3】，涡旋洗涤2 min，置于磁力架弃上清；

2)重复洗涤5~10次。

注意事项：

a)多次洗涤对改善背景有一定的帮助；

b)涡旋转速推荐2500×g；

c)如果想进一步降低背景，可以使用Buffer C（1×）（strong）【3】进行洗涤，但或会破坏目标复合物之间的互作。

7.提取蛋白与RNA

1)洗脱结合在磁珠上的复合物（Input样品使用相同方法提取）

①在磁珠复合物中加入Buffer E 300 μL【10】， Input样本中加入Buffer E 200 μL【10】，涡旋30 s；

②置于磁力架，收集上清；

2)过柱去除DNA

①将上清加入DR Columns【8】滤柱；

②14000 g，离心2 min，收集滤液；

③在滤液中加入等体积的70%乙醇，移液器吹打3~5次；

3)过柱纯化RNA

1.将混有70%乙醇的滤液加入RC Columns【9】滤柱；

2.12000 g，离心30~60 s，将含滤液收集用于蛋白提取；

3.在RC Columns【9】滤柱上加入500 μL Buffer F(含乙醇)【11】；

4.12000 g，离心30~60 s，弃滤液；

5.在RC Columns【9】滤柱上加入500 μL Buffer G（含乙醇）【12】；

6.12000 g，离心30~60 s，弃滤液；

7.在RC Columns【9】滤柱上加入500 μL  Buffer G（含乙醇）【12】；

8.12000 g，离心30~60 s，弃滤液；

9.空柱12000 g，离心2 min，弃滤液；

10.将滤柱转移至新的无RNase离心管中，加入30~100 μL RNase free water【13】至柱膜中央；

11.室温静置2 min；

12.12000g，离心1 min；

13.收集到的RNA保存于-80℃。

4)蛋白提取

①取第7-3)-②步获得的滤液，加入4倍体积冰冷的丙酮（自备），涡旋混匀30 s；

②冰上放置30 min沉淀蛋白质；

③小心去除上清，加入1 mL无水乙醇（自备），涡旋混匀；

④室温，12000 g，离心3 min，小心去除上清；

⑤短暂离心，彻底吸弃残留的乙醇；

⑥空气干燥5~10 min；

⑦根据下游实验应用，加入缓冲液至蛋白质沉淀中，使其溶解。

注意事项：

a)Input样品量不宜过多，否则会堵塞柱子；

b)反复的对样品进行冻融会造成RNA的降解，确保冻融不超过2次；

c)试剂盒中提供的RNase Free Water【13】不含抑菌剂，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染。可使用新的RNase Free Water【13】或DEPC处理水（自备）；

d)用DEPC处理水配制70%乙醇；

e)70%乙醇可使用Buffer G（含乙醇）【12】替代；

f)RNase Free Water【13】需垂直滴加到膜上，并静置几分钟后再离心，进行第二次洗脱（滤液再加回柱子再次洗脱）可提高RNA产量。

g)由于洗脱柱的容量及洗脱能力有限，因此如果产物量不够下游实验要求，如测序，可以重复实验，合并产物。

h)溶解蛋白的缓冲液可以是裂解液或PBS，用枪头将蛋白沉淀在管壁上挤压、旋转打散，再小心吹打溶解。不可直接使用loading buffer，否则蛋白沉淀无法溶解。一般添加缓冲液体积建议为50ul。

 8.产物分析

1)蛋白产物分析

RIP实验洗脱蛋白产量一般较低，可直接取20ul进行WB检测。目的蛋白丰度、富集效率、抗体质量等均可从WB结果中判断，可依据结果对实验条件或操作进行相应调整。

2)RNA产物分析

洗脱纯化的RNA，产物量一般不足以直接测量出浓度，可通过定量RT-PCR（如果已知RBP的结合靶基因），或通过测序技术进行分析。

●qPCR数据处理

3)结果示例图

注意事项：

a)对于反转录，用户可以使用任何商用反转录试剂盒。

b)由于RNA浓度未知，建议取所用反转录体系的最大上样量进行逆转录。

常见问题及处理方法