circRNA qRT-PCR Kit
Cat.No.GS0201
本产品包含逆转录及环状RNA的定量PCR检测试剂。提取得到总RNA或环状RNA即可应用本产品完成环状RNA的定量PCR检测。
本产品的TransScript RT Enzyme (M-MLV)是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新逆转录酶。大幅提高了热稳定性,在50℃的半衰期超过240分钟,并可在55℃长时间反应而保持稳定,非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。定量PCR检测的试剂是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。配合针对qPCR优化的最适Buffer,可以有效抑制非特异扩增,显著提高扩增效率,适用于进行高灵敏度的qPCR反应。
本产品应置于-20℃避光保存;使用过程中请尽量避免反复冻融。
1.本产品尽量避免反复冻融,以免酶活下降。如每次使用量较少,推荐小份分装使用。
2.使用前请上下颠倒混匀,请勿vortex以免产生过多气泡引起反应体系失准,进而影响定量结果。混匀后轻微离心后即可使用。如操作不慎产生气泡,请再次离心后使用。
3.由于产品中的2×qPCR SYBR Green Master Mix含有荧光染料SYBR Green I,因此无论保存Mix还是配置反应体系时都应该尽量避免强光照射。
1.逆转录
a.配制第一链cDNA合成反应液
在RNase free离心管中配制如下混合液:
用移液器轻轻吹打混匀。
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
25°C,10min;
42°C,30min;
85°C,5min;
* 如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可将反应温度提高至50°C ,有助于提高产量。
产物可立即用于PCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。
2.实时定量PCR检测
用ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300 System、7500 System的操作方法;请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作(其他类型的荧光定量PCR仪器请按照说明书操作)。
a.按下列组分配置PCR 反应液:
b.进行Real Time PCR反应
Stage1:预变性95℃,5min;
Stage2:PCR反应
95℃,10s,
60℃ 30~34s,
40 cycles;
退火温度根据引物来设定。
使用7700和7900HT时请设定在30s。
使用7000和7300时请设定在31s。
使用7500时请设定在34s。
Stage3:融解曲线
95℃ 1min,
55℃ 1min,
55℃-98℃(10s/cycle 0.5℃/cycle)
circRNA qRT-PCR Kit
Cat.No.GS0202
本产品的TransScript RT Enzyme (M-MLV)是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新逆转录酶。大幅提高了热稳定性,在50℃的半衰期超过240分钟,并可在55℃长时间反应而保持稳定,非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。
本产品应置于-20℃避光保存;使用过程中请尽量避免反复冻融。
1.本产品尽量避免反复冻融,以免酶活下降。如每次使用量较少,推荐小份分装使用。
2.使用前请上下颠倒混匀,请勿vortex以免产生过多气泡引起反应体系失准,进而影响定量结果。混匀后轻微离心后即可使用。如操作不慎产生气泡,请再次离心后使用。
a.配制第一链cDNA合成反应液
在RNase free离心管中配制如下混合液:
用移液器轻轻吹打混匀。
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
25℃,10min;
42℃,30min;
85℃,5min;
* 如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可将反应温度提高至50℃ ,有助于提高产量。
产物可立即用于PCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。
circRNA qRT-PCR Kit
Cat.No.GS0203
本产品的试剂是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。配合针对qPCR优化的最适Buffer,可以有效抑制非特异扩增,显著提高扩增效率,适用于进行高灵敏度的qPCR反应。
本产品应置于-20℃避光保存;使用过程中请尽量避免反复冻融。
1.使用前请上下颠倒混匀,请勿vortex以免产生过多气泡引起反应体系失准,进而影响定量结果。混匀后轻微离心后即可使用。如操作不慎产生气泡,请再次离心后使用。
2.由于产品中的2×qPCR SYBR Green Master Mix含有荧光染料SYBR Green I,因此无论保存Mix还是配置反应体系时都应该尽量避免强光照射。
用ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300 System、7500 System的操作方法;请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作(其他类型的荧光定量PCR仪器请按照说明书操作)。
a.按下列组分配置PCR反应液:
b.进行Real Time PCR反应
Stage1:预变性95℃,5min;
Stage2:PCR反应
95℃,10s,
60℃ 30~34s,
40 cycles;
退火温度根据引物来设定。
使用7700和7900HT时请设定在30s。
使用7000和7300时请设定在31s。
使用7500时请设定在34s。
Stage3:融解曲线
95℃ 1min,
55℃ 1min,
55℃-98℃(10s/cycle 0.5℃/cycle)
1.CT值出现太晚或检测为阴性
a)扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序。
b)模板浓度太低:减少稀释度重复试验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
c)模板降解:重新制备模板,重复试验。
2.反应结束无扩增曲线出现
a)circRNA在细胞株或组织中不表达:更换模板。
b)反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环数会增加过多的背景信号,降低数值可信度。
c)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
d)模板浓度太低:减少稀释度重复试验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
e)模板降解:重新制备模板,重复试验。
3.阴性对照也出现明显扩增
a)反应体系或水被污染:更换新的Mix或者水重复试验。反应体系在超净工作台内配置,减少气溶胶污染。
4.实验重复性差
a)加样体积失准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。
b)定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
c)模板浓度太低:模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。
5.本产品是否可以4℃储存
a)不可以。4℃储存将会导致产品活性下降。
b)该产品-20℃储存可以长期保持活性,推荐-20℃储存。
c)因反复冻融也可能导致产品活性下降,因此当每次用量较小时,推荐小体积分装后-20℃储存。