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circRNA qRT-PCR试剂盒


circRNA qRT-PCR Kit

Cat.No.GS0201

产品概要

本产品包含逆转录及环状RNA的定量PCR检测试剂。提取得到总RNA或环状RNA即可应用本产品完成环状RNA的定量PCR检测。

本产品的TransScript RT Enzyme (M-MLV)是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新逆转录酶。大幅提高了热稳定性,在50℃的半衰期超过240分钟,并可在55℃长时间反应而保持稳定,非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。定量PCR检测的试剂是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。配合针对qPCR优化的最适Buffer,可以有效抑制非特异扩增,显著提高扩增效率,适用于进行高灵敏度的qPCR反应。


产品组成

image

储藏与保质期

本产品应置于-20℃避光保存;使用过程中请尽量避免反复冻融。


实验操作注意事项

1.本产品尽量避免反复冻融,以免酶活下降。如每次使用量较少,推荐小份分装使用。

2.使用前请上下颠倒混匀,请勿vortex以免产生过多气泡引起反应体系失准,进而影响定量结果。混匀后轻微离心后即可使用。如操作不慎产生气泡,请再次离心后使用。

3.由于产品中的2×qPCR SYBR Green Master Mix含有荧光染料SYBR Green I,因此无论保存Mix还是配置反应体系时都应该尽量避免强光照射。

操作方法

1.逆转录

a.配制第一链cDNA合成反应液

RNase free离心管中配制如下混合液:

image

用移液器轻轻吹打混匀。

b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应

25°C,10min;

42°C,30min;

85°C,5min;

* 如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可将反应温度提高至50°C ,有助于提高产量。

产物可立即用于PCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。

2.实时定量PCR检测

ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300 System、7500 System的操作方法;请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作(其他类型的荧光定量PCR仪器请按照说明书操作)。

a.按下列组分配置PCR 反应液:

image

b.进行Real Time PCR反应

Stage1:预变性95℃,5min

Stage2:PCR反应

95℃,10s,

60℃ 30~34s,

40 cycles;

退火温度根据引物来设定。

使用77007900HT时请设定在30s

使用70007300时请设定在31s

使用7500时请设定在34s

Stage3:融解曲线

95℃ 1min,

55℃ 1min,

55℃-98℃(10s/cycle 0.5℃/cycle)



circRNA qRT-PCR Kit

Cat.No.GS0202


产品概要

本产品的TransScript RT Enzyme (M-MLV)是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新逆转录酶。大幅提高了热稳定性,在50℃的半衰期超过240分钟,并可在55℃长时间反应而保持稳定,非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。

产品组成

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储藏与保质期

本产品应置于-20℃避光保存;使用过程中请尽量避免反复冻融。

实验操作注意事项

1.本产品尽量避免反复冻融,以免酶活下降。如每次使用量较少,推荐小份分装使用。

2.使用前请上下颠倒混匀,请勿vortex以免产生过多气泡引起反应体系失准,进而影响定量结果。混匀后轻微离心后即可使用。如操作不慎产生气泡,请再次离心后使用。

操作方法

a.配制第一链cDNA合成反应液

RNase free离心管中配制如下混合液:

image

用移液器轻轻吹打混匀。

b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应

25,10min;

42,30min;

85,5min;

* 如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可将反应温度提高至50 ,有助于提高产量。

产物可立即用于PCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。



circRNA qRT-PCR Kit

Cat.No.GS0203


产品概要

本产品的试剂是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。配合针对qPCR优化的最适Buffer,可以有效抑制非特异扩增,显著提高扩增效率,适用于进行高灵敏度的qPCR反应。


产品组成

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储藏与保质期

本产品应置于-20℃避光保存;使用过程中请尽量避免反复冻融。

 

实验操作注意事项

1.使用前请上下颠倒混匀,请勿vortex以免产生过多气泡引起反应体系失准,进而影响定量结果。混匀后轻微离心后即可使用。如操作不慎产生气泡,请再次离心后使用。

2.由于产品中的2×qPCR SYBR Green Master Mix含有荧光染料SYBR Green I,因此无论保存Mix还是配置反应体系时都应该尽量避免强光照射。

 

操作方法

ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300 System、7500 System的操作方法;请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作(其他类型的荧光定量PCR仪器请按照说明书操作)。

a.按下列组分配置PCR反应液:

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b.进行Real Time PCR反应

Stage1:预变性95℃5min;

Stage2:PCR反应

95℃10s

60℃ 30~34s

40 cycles

退火温度根据引物来设定。

使用77007900HT时请设定在30s

使用70007300时请设定在31s

使用7500时请设定在34s

Stage3:融解曲线

95℃ 1min,

55℃ 1min,

55℃-98℃(10s/cycle 0.5℃/cycle)


常见问题与解决方案(GS0201、GS0202、GS0203)

1.CT值出现太晚或检测为阴性

a)扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序。

b)模板浓度太低:减少稀释度重复试验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

c)模板降解:重新制备模板,重复试验。

2.反应结束无扩增曲线出现

a)circRNA在细胞株或组织中不表达:更换模板。

b)反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环数会增加过多的背景信号,降低数值可信度。

c)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

d)模板浓度太低:减少稀释度重复试验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

e)模板降解:重新制备模板,重复试验。

3.阴性对照也出现明显扩增

a)反应体系或水被污染:更换新的Mix或者水重复试验。反应体系在超净工作台内配置,减少气溶胶污染。

4.实验重复性差

a)加样体积失准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。

b)定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。

c)模板浓度太低:模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

5.本产品是否可以4℃储存

a)不可以。4℃储存将会导致产品活性下降。

b)该产品-20℃储存可以长期保持活性,推荐-20℃储存。

c)因反复冻融也可能导致产品活性下降,因此当每次用量较小时,推荐小体积分装后-20℃储存。

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