Ribonuclease R

试剂组分

RNase R (Ribonuclease R)是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。RNase R常用于基因表达和可变剪切研究，可消化线性RNA以使环形RNA (circRNAs)或套索结构RNA (lariat RNA)得到富集。

产品组分：

单位定义：

标准反应体系下，于37℃，10 min将1 μg poly(A)转化成酸溶核苷酸所需的酶量定义为一个活力单位(U)。

反应体系：

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM MgCl2, 37℃孵育。

注：1）RNase R在0.1-0.5 mM Mg2+存在时活性最高，反应中EDTA可能降低RNase R活性，此时可额外添加MgCl₂使Mg²⁺浓度最高达到0.5mM。2）孵育后可于70℃，10 min使酶失活，再进行下游实验（如逆转录）；也可不灭活，直接纯化后进行下游实验。

质量控制：

SDS-PAGE检测纯度>95%；Total RNA经RNase R消化后进行RT-qPCR检测，线性RNA丰度明显降低，环形RNA丰度基本不变。

RNase R消化实验：

1 反应体系

*：RNase R反应体系需根据实验进行调整。一般情况下，3 U RNase R在37℃下反应15min几乎完全消除1μg 线性RNA。

2 纯化回收

消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇（25: 24:1, V: V）溶液(或Trizol Reagent）抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA纯化柱或磁珠进行纯化回收。

注：经RNase R消化后可不做纯化，70℃保持10 min失活RNase R后可直接进行RT-PCR。

常见问题：

1 消化时间的选择

一般10-30 min即可消化掉大部分线性RNA，PCR检测线性RNA丰度有几百倍的降低，也可按需求适当延长消化时间，但不推荐1h以上的消化，因为时间过长可能导致少数耐受力弱的circRNAs被消化。

2 内参的选择与定量计算

1）情况1：RNase R消化后“直接”进行RT-qPCR检测对消化组（RNase R+）与对照组（RNase R-）的circRNA的进行定量计算时，应统一以对照组（RNase R-）的β-actin或GAPDH为内参。

2）情况1：RNase R消化后“纯化回收”再进行RT-qPCR检测在纯化前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后再进行计算。

3 实验结果一致性（重复性）差

1）RNase R消化/逆转录/PCR过程中加样不准确；

2）RNase R的用量有偏差；

3）其他RNase污染。

4 线性RNA消化不成功

1）反应体系中的NaCl浓度过高抑制了RNase R的活性，或存在RNase R的失活剂EDTA；

2）某些没有3’突出末端的结构化线性RNA或含有G-四联体的线性RNA可能耐受RNase R消化。

5 环状RNA也被消化了

1）外源RNase污染，使用RNase-Free耗材，反应体系可适当加入RNase inhibitor；

2）少数circRNAs耐受RNase R消化力弱的，可尝试减少RNase R用量或缩短消化时间。